La città prima etrusca di "Clevsi" diventata poi la latina "Clusium", aveva un'importanza fondamentale, poiché collocata sull'arteria che collegava Roma all'Etruria settentrionale. Gli autori antichi la ricordano come città antica e potente e ne lodano la fertilità del suolo. L'abitato etrusco si sviluppava sui tre colli sui quali sorse poi la città medievale e moderna. Tuttavia, è molto probabile che l'antico abitato della capitale chiusina si estendesse ben oltre l'attuale centro storico. Chiusi sorge su un colle da cui si domina la valle dell'antico fiume Clanis, nel punto d'incontro tra il Clanis e l'odierna val di Tresa, ovvero nel punto in cui le acque provenienti dal Trasimeno incontravano il Clanis (antecedentemente alla costruzione dell’emissario di S. Savino di epoca romana), ed era un luogo strategico nel bacino del Clanis (oggi val di Chiana).
Il territorio della città-stato di Chiusi (ager Clusinum, in latino) era estremamente vasto, tanto da comprendere una parte del Trasimeno, il monte Cetona, il monte Amiata, il monte Arale, la Val d'Orcia e, in definitiva, una parte delle odierne province di Grosseto, Perugia, Siena, Terni e in minor misura di Arezzo.
Nel VII secolo a.C. venne introdotto il rito dell'inumazione e si diffusero le tombe a camera con pilastro.
Nel VI secolo a.C. Chiusi divenne una delle più importanti città della dodecapoli etrusca, primeggiando tra i Populi etruschi, specie al tempo del lucumone Porsenna. A questo periodo risalgono i primi contatti certi con la neonata Roma, quando un'alleanza di Chiusi con Arezzo, Volterra, Vetulonia e Roselle (l'attuale Grosseto) venne in aiuto ai Latini per sconfiggere Tarquinio Prisco. Tra le tombe a camera del periodo spicca ancora oggi quella di Poggio Gaiella, forse usata per il potente re lucumone Porsenna, che mise Roma sotto assedio nel 506 a.C. e che, probabilmente, dominò altre città etrusche come la vicina Orvieto, tanto da divenirne "re", come evidenzia Livio. Risale a questo periodo il massimo splendore della città, con la nascita di un ceto medio-alto, i cui membri venivano sepolti in tombe articolate, scavate nell'arenaria.
Chiusi divenne inoltre un grande centro di importazione dall'Attica, che fungeva da luogo di smistamento per tutta l'Etruria interna.
Il V secolo a.C. è testimoniato dalla produzione scultorea in pietra fetida, estratta in loco, mentre si dovette aspettare la fine del IV e l'inizio del III secolo a.C. per vedere la nascita della fabbricazione dei tipici sarcofagi e urne, soprattutto in alabastro e marmo alabastrino. Nel II secolo si affiancò anche la produzione di urne cinerarie in terracotta.
Dopo la sconfitta della lega etrusca ad opera dei Romani (III a.C.) l'Etruria fu progressivamente romanizzata e la città etrusca di Chiusi continuò a reggersi con proprie leggi e ad essere amministrata da nobili famiglie etrusche, legate all'aristocrazia romana, che consentirono la costruzione d'infrastrutture romane quali la consolare Cassia (sec. II a.C.) e porti fluviali lungo il Clanis, per l'utilità dell'emergente potenza romana.
Nell'anno 87 a.C. Clusium divenne un importante municipio romano; l'ager Clusinum
corrispondeva alle dimensioni dell'estinta città-stato, e i suoi abitanti erano probabilmente e in buona misura stanziati, tra l'altro, nel fondovalle, lungo la consolare Cassia e il navigabile Clanis, paralleli e attigui.
Al tempo dell'imperatore Adriano fu realizzato un diverticolo della Cassia,
all'altezza di Acquaviva, che collegò il municipio di Chiusi con la colonia
senese (Sena Iulia). Nel 107 fu completata la consolare Traiana Nova' che
collegò Bolsena (Volsinii Novi) con Chiusi senza passare per Orvieto. Con la realizzazione di tali arterie stradali la centralità di Chiusi nell'Etruria settentrionale fu notevolmente accentuata.
A Chiusi era probabilmente stanziato il comando della Quarta Legio (quarta legione) e certamente si trovavano importanti infrastrutture portuali, lungo il fiume navigabile, dove i copiosi cereali della valle del Clanis erano stoccati, lavorati e quindi trasportati a Roma (che in età imperiale contava quasi un milione di abitanti) per mezzo di imbarcazioni fluviali.
I cristiani, perseguitati a Roma, fuggivano per rifugiarsi in grande numero nel municipio chiusino: sono tuttora presenti due catacombe paleocristiane, ambedue poste lungo le consolari,
cioè S. Caterina lungo la via Cassia e Santa Mustiola (patrona della città) ubicata lungo la via Amerina, a poche centinaia di metri dal ponte romano sul Clanis, attualmente sepolto dai sedimenti.
Il corpo della martire Santa Mustiola (di nobile famiglia, che fuggendo da Roma giunse a Chiusi attraverso la consolare Amerina), già deposto nell'omonima catacomba, nel IV secolo d.C. fu traslato nella basilica a lei dedicata, posta sopra detta catacomba, e collocato in un sarcofago in pietra calcarea. Sempre nel IV secolo d.C., per proteggere le catacombe dalle invasioni barbariche i loro ingressi furono interrati, tanto che le stesse sono state riscoperte solo in tempi recenti essendo oggi visitabili. Durante le invasioni barbariche le consolari Aurelia e Flaminia divennero in buona parte impercorribili e furono abbattuti alcuni ponti strategici sul Tevere, come quello lungo la Flaminia (interrotta) che si trovava presso il municipio di Otricoli (Ocricolum).
Durante le due guerre gotiche (VI secolo), i Bizantini e i Goti lottarono per la conquista dell'ambita città, e grande doveva essere l'interesse per il suo controllo se Vitige vi lasciò una guarnigione di mille uomini. Durante il breve periodo bizantino fu operata la ricostruzione di ciò che era stato distrutto, e i Bizantini eressero stupende cattedrali in importanti capoluoghi italiani come Chiusi e Roma, similari a quella di
S. Apollinare a Ravenna. Nel principale colle di Chiusi, sul perimetro di una basilica paleocristiana, fu realizzata la basilica di San Secondiano, rimasta pressoché intatta, fatta eccezione per alcune varianti architettoniche dei secoli successivi. L'ultimazione della basilica risale probabilmente al 565, al tempo del vescovo Florentinus, come è attestato da un'iscrizione posta nel pulvino di una colonna all'interno di S. Secondiano.
Quando i Longobardi scesero in Italia, nel 568, fecero di Chiusi un ducato. Il ducato longobardo di Chiusi controllava i confini occidentali del
"corridoio bizantino" e la Tuscia meridionale, essendo molto più esteso dell’antico ager chiusino; esso infatti comprendeva anche Cortona, Arezzo, Chiusi della Verna (Clusi Novi), l'alto Lazio sino al torrente Mignone (tra cui Viterbo e Bolsena), l'intera attuale provincia di Grosseto e buona parte delle odierne province di Perugia, Terni e Siena.
Nell'VIII secolo i Franchi conquistarono l'Italia e tentarono inutilmente di domare lo strapotere dei duchi longobardi di Chiusi e di Spoleto. Sul finire dell’VIII secolo il pontefice romano lamenta incursioni e saccheggi del Duca di Chiusi a danno di Roma e dell'ager romano.
Nel 932, a seguito di un'invasione saracena in seno alla quale è saccheggiato il territorio di Roselle, gli Aldobrandeschi si stabiliscono a Sovana e cominciano a dominare un ampio territorio che fino a quel momento faceva in buona parte capo a Chiusi.
Dalla fine del X secolo, in epoca pre-comunale, il capoluogo della Contea chiusina era non di rado occupato e dominato da famiglie, come i conti Bovacciani, sorrette dall'emergente città-stato di Orvieto, con alterne vicende.
Dalla fine dell’XI secolo e per quasi tutto il XII secolo, nonostante le difficoltà, si assiste a un rifiorire, anche architettonico, della città di Chiusi e in particolare del suo vescovado, che assesta duri colpi ad alcuni nobili del circondario legati alla città-stato di Orvieto, e si rimpossessa di enti ecclesiastici, nel proprio contado, di cui in precedenza aveva perduto il controllo, anche a Est delle Chiane.
Nel 1111, a fronte di una donazione dell’imperatore Enrico V fatta al papato di Pasquale II in cambio dell’incoronazione imperiale, la contea-diocesi di Chiusi fu spaccata in due dalla linea di confine del Patrimonio di San Pietro, avanzato a nord, essendo il vescovo chiusino costretto a una politica di continue mediazioni. È in questo periodo che si assiste a un grande splendore della scuola di arti liberali chiusina, che si trovava nel Claustrum Sancti Secundiani Clusini Episcopatus, in cui operarono teologi-giuristi di grande livello come il celebre Graziano, autore
probabilmente della originaria versione della Concordia discordantium canonun, più conosciuta come Decretum o Decretum Gratiani, il quale, dalla fine degli anni venti del XII secolo fu anche vescovo di Chiusi.
Alla fine del XII secolo, con la morte dell’imperatore del Sacro Impero Germanico Enrico VI e con la prima grande ondata di malaria (1191), Chiusi si indebolisce al punto da essere per l’ennesima volta riconquistata dalla città-stato di Orvieto, mentre a Est delle Chiane i coloni della città-stato di Perugia occupano definitivamente l’area orientale della contea chiusina, il
cosidetto "Chiugi perugino".